光片掃描顯微鏡的基本光學布局與傳統顯微鏡有很大不同，但它相對來說更加直接。檢測路徑大致與寬場熒光顯微鏡相同：檢測物鏡收集從其焦平面射出并通過濾光片的光，然后管透鏡再將光投射到相機芯片上。

 

　　由于不需要在檢測路徑中引入激發光，所以不需要二色鏡。不尋常的是照明路徑與檢測路徑正交，主要由相干光源和光學元件組成的照明路徑形成光片并通過照明透鏡將其投射到樣本上。

 

對光片掃描顯微鏡性能至關重要的是光片的特性，比如光片的厚度、均勻性和穿透散射組織的能力。理想情況下，如果一片光只照亮檢測物鏡的焦平面，就會得到一個非常薄的光學切面，同時該光片要盡可能薄且能均勻穿過整個視野范圍。

 

　　光片顯微鏡的基本結構是結合了兩條相互正交的不同光路，一條用于快速寬視場的檢測，另一條通過一片薄光片用于照明。一般來說，光片處于檢測路徑的焦平面上，光片的束腰處于視野的中間，在使用靜態光片時整個視野可以同時被照亮，從而使每條線的功率大大降低并且可以不受掃描鏡速度的限制獲得更高的速度，而僅受相機速度的限制。

 

　　如果配合更快且靈敏度更高的相機，光片顯微鏡獲取非常大的圖像數據組的能力會比其他任何技術都快得多，同時仍然保證了信噪比和光毒性。光片照明在對大樣本進行成像時用低NA、低放大率和長工作距離物鏡的顯微鏡尤其有利。在光片顯微鏡的橫向分辨率與寬場熒光顯微鏡相同時，軸向分辨率主要由光片厚度決定。